来源：PrecisionClinMed
基因治疗是近年来医学界的热门领域之一。2017年12月，美国食品药物管理局（FDA）批准了第一个体内（in vivo）基因治疗药物Luxturna（Voretigene neparvovec），标志着基因治疗领域又一个里程碑式的突破。近期，美国加州大学圣地亚哥分校张康教授和上海交通大学第一人民医院眼科孙晓东教授的团队在Precision Clinical Medicine杂志发表综述，详细总结了视网膜疾病基因治疗的最新进展和成果。结合这篇综述，本文将简要介绍基因治疗及其在视网膜疾病方面的应用。
1 视网膜疾病的基因治疗
眼球和视网膜在结构和功能上的独特优势使得视网膜疾病成为基因治疗研究的前沿阵地之一。首先，眼球是一个很小的相对密闭的系统，眼部基因治疗引起系统性并发症或副作用的可能性较小，相对于其他部位安全性更好。另外，视网膜基因治疗的注射部位视网膜下腔是免疫赦免部位之一，这意味着载体病毒不会或只引起轻微的免疫反应。这样一方面可以提高基因治疗的疗效，另一方面能避免或减少免疫反应引起的并发症。
1.1 先天性黑朦（RPE65-Leber’s，LCA2）
LCA2是一种由RPE65双等位基因突变导致的遗传性视网膜疾病。RPE65是表达于视网膜色素上皮的特异蛋白，一种视黄醇异构酶。其主要功能是把全反式视黄醛转变为11-顺视黄醛，从而逆转光异构过程（Photoisomerization），为下一个视觉循环提供必须的11-顺视黄醛。缺少RPE65或RPE65功能异常则引起全反式视黄醛淤积，光传导过程中断，最终无法产生视色素。LCA2是一种罕见的先天性疾病，新生儿中的发病率低于百万分之一。
宾州大学的Jean Bennett和Albert Maguire夫妇及其团队经过几十年的潜心研究，终于研制出基因治疗药物Luxturna（Voretigene neparvovec）。2017年10月，该药物在FDA的审批过程中被授予优先审批，最终获得了审批小组16名专家的一致通过。Luxturna是携带人类RPE65 cDNA的AAV2，治疗途径是视网膜下腔注射。治疗适应症还包括其他的RPE65基因突变引起的遗传性视网膜疾病，但必须是单基因致病类型，因此术前基因测试非常重要。该药由Spark Therapeutics公司生产，费用是每只眼$425，000。
1.2 MERTK相关的常染色体隐性遗传视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa，RP）
视网膜色素变性是一组原发于视网膜视杆细胞的遗传性视网膜变性疾病，是最常见的视网膜致盲疾病之一，在全世界有一百多万患者。目前已知的RP突变基因有200多种，MERTK基因是其中之一。MERTK是一种受体酪胺酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase，RTK），其功能是维持视网膜色素上皮细胞对感光细胞外节的吞噬作用。在MERTK相关的这类视网膜色素变性中，由于色素上皮细胞吞噬功能失常，造成视网膜下感光细胞外节废弃物堆积，最终导致视网膜色素上皮和感光细胞的死亡。动物模型实验显示，MERTK基因治疗可以地成功地保护视网膜结构及其功能。研究显示，如果在MERTK基因治疗中联合应用表达胶质细胞衍生神经营养因子的AAV，疗效会更好。在一项包含6个病人的临床I期试验中，没有发现任何AAV载体相关的并发症，而且有3个病人的视力得到了改善。但是，两年后的随访结果显示，其中2个病人的视力又有所减退。由于该基因治疗已经通过了安全性试验，研究者正在招募更多志愿者，尤其是视力仍然较好的患者，以检测治疗效果。
1.3 Usher综合症（Usher Syndrome）
Usher综合征是一种以耳聋和视网膜色素变性为特征的常染色体隐性遗传病。共有三个亚型：USH1、USH2和USH3，其中USH1是最严重的亚型。Usher综合征最常见的致病基因是MYO7A基因（或USH1b），负责编码肌凝蛋白VIIA，主要分布在内耳和视网膜。约60%的USH1b型病例是由MYO7A基因突变引起的。在动物模型shaker 1小鼠中，慢病毒携带的MYO7A基因恢复了视网膜色素上皮细胞顶部运输黑色素体和转运视蛋白的功能。在此基础上，英国的Oxford Biomedica公司采用一种名为UshStat的产品开展了一个临床I期试验。该产品使用马感染性缺血病毒（Equine Infectious Anemia Virus，EIAV）为基础的慢病毒载体来携带MYO7A基因。然而，这种慢病毒的局限性是仅能转导至视网膜色素上皮，而不是该病最初的发病部位：感光细胞。为了解决这个问题，一种双AAV载体应用而生。由于AAV载体的容量小，不能携带较大的DNA，必须把MYO7A的cDNA分成两半再包装到两个AAV载体内。一旦进入细胞后，这两个不完整的cDNA片段又可以重新整合成一个完整的cDNA。这些双AAV载体已经在动物模型实验中成功地将MYO7A基因导入视网膜色素上皮细胞和感光细胞。在进入临床试验前，这一技术还有待进一步研究以确定其长期安全性和疗效。
1.4 Stargardt氏症（Stargardt disease）
Stargardt氏症是一种常染色体隐性遗传的黄斑变性疾病，起病于青少年期。突变基因是ABCA4基因，编码一种ATP结合盒转运蛋白（ATP binding cassette）。该蛋白质特异性地分布于感光细胞的外节，在视觉循环中发挥重要的作用。基因突变会造成转运蛋白功能下降或消失，毒性物质Bisretinoid滞留，引起视网膜色素上皮细胞内脂褐素（Lipofuscin）的淤积，最终导致视网膜色素上皮细胞和感光细胞变性。目前Stargardt氏症的基因治疗涉及使用不同的载体。由于ABCA4基因超出了一般AAV载体的容量，研究者在动物实验中选用了超大型AAV或双AAV载体以及慢病毒载体。其中慢病毒的效果要优于AAV，尤其是以EIAV为基础的慢病毒。在动物实验的基础上，目前有两个I/II期的临床试验来验证EIAV慢病毒的短期和长期安全性以及病毒耐受性。
1.5 其他的遗传性视网膜疾病
基因治疗研究还涉及了其他的视网膜疾病包括无脉络膜症（Choroideremia），先天性色盲（Achromatopsia）和X-染色体遗传的青少年型视网膜劈裂（X-linked juvenile retinoschisis）。目前针对这些罕见遗传性疾病的基因治疗都处于I/II期临床试验阶段，详情可参见张康教授综述中关于各种临床试验的总结表。
1.6 湿性老年黄斑变性
不同于那些发病率很低的遗传性视网膜疾病，湿性老年黄斑变性是65岁以上人群中最常见的致盲疾病。目前主要的治疗手段是抗血管内皮生长因子（Anti-VEGF）药物疗法，但该方法无法治愈疾病，且需要长期频繁地注射药物，不仅有眼内炎的危险，还给病人造成沉重的经济和精神负担。因此，成功的基因疗法可以造福全世界上千万的患者，临床价值极大。作为相关疾病的专科医生，这是我最关注的基因治疗。
和目前的临床治疗一样，黄斑变性基因治疗的策略也是通过对抗VEGF来抑制新生血管的生长，但工作机理不同于上述基因治疗。在黄斑变性治疗中，治疗基因的作用不是取代或关闭突变基因，而是生产大量治疗蛋白来对抗VEGF，所以战场是在蛋白质层面。目前的研究主要集中在VEGF的可溶性受体上特别是sFLT-1。通过AAV2载体进入细胞的sFLT-1基因可以生产大量的可溶性受体sFLT-1。这些受体可以拦截VEGF，竞争性结合VEGF，从而阻止VEGF和细胞膜上的功能性受体结合，导致下游的信号途径无法激活。现阶段的临床I/II期试验已经验证了这一方案的安全性和耐受性。
其他抑制新生血管的因子还包括色素上皮衍生因子（Pigment Epithelium Derived Factor，PEDF），血管抑素（Angiostatin）和内皮抑素（Endostatin）。临床试验发现PEDF可以轻微抑制新生血管，但疗效不能持久。而表达血管抑素和内皮抑素的EIAV慢病毒载体（RetinoStat）在治疗晚期湿性老年黄斑变性病人的I期临床试验中显示了较好的安全性和耐受性及长期的基因表达。但是，该药物还无法稳定地消除严重病例中的视网膜下和/或视网膜内积液。
1.7 CRISPR/Cas9介导的基因治疗
传统载体介导的基因治疗已经取得了巨大的成功，但也有其先天的不足，比如只能用来治疗单基因突变的疾病。同样，再生医学也面临着类似的局限性。在应用内源性干细胞进行修复和再生时，起始干细胞必须是具有正常的基因组成和功能的细胞。如果起始干细胞携带某种致病的基因突变，那么从干细胞衍生的再生细胞也会面临同样的疾病，导致治疗失败。采用最新的治疗性细胞重编程疗法（Therapeutic cellular reprogramming）不仅可以发挥两者的长处还能克服上述的缺点。在该疗法中，应用CRISPR/Cas9技术可以将对某种突变敏感的细胞类型转变成不敏感的类型，这样既清除了潜在的致病突变，又保留了细胞的功能。
治疗性细胞重编程最早应用于视网膜色素变性（RP）的基因治疗。由于RP涉及200多基因突变，远远超出了传统基因治疗的范围。张康教授的实验室联合应用了AAV载体系统和CRISPR/Cas9介导的靶向灭活技术，在幼鼠RP模型内成功地灭活了视杆细胞基因Nrl或下游转录因子基因Nr2e3，从而将视杆细胞重新编程，转而分化成视锥细胞。而这些分化的视锥细胞因对RP致病基因不敏感，所以能够存活并进一步防止视锥细胞的继发性死亡，挽救视功能。研究结果显示，治疗性细胞重编程是一种不局限于基因和突变的新疗法，大大拓展了基因治疗的适用范围。
2 未来和挑战
毫无疑问，基因治疗是医学未来的发展方向之一。虽然基因治疗已经取得了巨大的进步，并开始了临床应用，但目前还处于初级阶段，面临着诸多挑战和问题。首先是安全性。病毒载体是一把双刃剑，不但本身具有毒性，还可以引起严重的免疫反应或影响宿主的基因控制，甚至可导致生殖系突变而影响后代。著名的Jesse Gelsinger案例（1999）就是腺病毒载体引起的致命免疫反应。另外，插入突变（Insertional Mutagenesis）也是一个严重的潜在风险。如果外源基因恰巧整合在基因组的一个敏感位点，比如一个肿瘤抑制基因位点，那么基因治疗就可能诱发肿瘤。CRISPR/Cas9技术可以通过控制插入位点来提高基因组改变的精确度以避免或减少这样的突变。另一个挑战是如何延长治疗基因在宿主细胞内的功能寿命，目标是治疗基因可以在体内保持稳定并随宿主细胞复制而不需要重复治疗。基因治疗还存在很多问题亟待解决，比如：如何治疗多基因疾病（糖尿病和老年痴呆症等）以及如何降低治疗费用等。
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